实验流程:

1.取适量FLUO-4 AM母液，用PBS稀释至0.5-5MM的工作液。

注:工作液须即用即配，请勿反复冻融。

2.对于待检测的培养细胞，去除培养液，用PBS或HBSS洗三遍。

注:因为培养液中的血清含有酯酶会导致Fluo-4 AM分解为Fluo-4，而酚红

会导致荧光背景增强。

3.加入Fluo-4 AM工作液，溶液量以能充分覆盖细胞为准。

4.20°C-37°C孵育10-60分钟进行荧光探针装载。

注:如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37°C孵育30分钟，

观察荧光效果。如果细胞死亡较多，则适当缩短时间或降低温度;如果荧光强

度太弱，则适当延长时间。

5.随后用PBS或HBSS洗涤3次，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保

Fluo-4 AM在细胞内完全转变成Fluo-4。

6.如有需要，可以使用适当药物来刺激细胞。

7.用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等荧光检测仪器检测Fluo-4的荧光，以

确定细胞内钙离子浓度的变化。

送样运输要求:

1、活细胞邮寄(1*10^6个/样)

(1)用T25培养瓶培养细胞，处理后用完全培养基灌满T25培养瓶，留少许空气。

(2)瓶口与盖过火，拧紧，并用封口膜将瓶盖与瓶口结合处封起来，同时封瓶

盖。

(3)将细胞用防震材料(如泡沫)固定培养瓶，常温邮寄。

注:如果是武汉本地样品，则可将6孔板细胞带培养基冰上运输

2、冷冻细胞带六孔板直接邮寄(1*10^6个/样)

弃去培养基，尽量迅速吸干细胞培养皿/孔板/瓶中液体，-80℃速冻后干冰运

输，冷冻细胞带六孔板直接邮寄

3、冷冻细胞邮寄(1*10^6个/样)

弃去培养基，尽量迅速吸干细胞培养皿/孔板/瓶中液体，PBS润洗后胰酶消化

3MIN,加等体积的含血清完全培养基终止消化，离心去上清，只要细胞团，-80

℃速冻后干冰运输。