实验流程:

1、对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳

性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。

2、对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或

自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

3、原位装载探针:本方法仅适用于贴壁培养细胞。

a、按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。

去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖

住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。

b、37°C细胞培养箱内孵育20分钟。

C、用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-

DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

4、收集细胞后装载探针:

a、按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。

细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，

37°C细胞培养箱内孵育20分钟。

b、每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

C、用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-

DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成

若干份后刺激细胞。

d、通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

检测:

1、对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细

胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

2、对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或

流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。

3.参数设置 使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测

刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设

置检测DCF。