实验流程:

1.样品染色

1)将 Binding Buffer(10x)稀释成1xBinding buffer 工作液备用(1mlB

inding Buffer(10x)需加入9ml无菌去离子水)

2)对于悬浮细胞，1000转/分，离心5MIN 收集细胞。对于贴壁细胞，要用

不含 EDTA 的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短，最好是在轻轻吹打

可以使贴壁细胞吹打下来时，加入完全培养基，将细胞轻轻吹打下来，转移到离

心管内，1000转/分离心5MIN 收集细胞。

3)收集细胞后，加入预冷PBS 溶液轻摇或用移液器轻柔吹打洗涤，离心收集

细胞，共洗涤两次。

4)在细胞沉淀中加入1xBinding buffer 工作液，重悬细胞，使细胞浓度达到

1x106 cell/ml。

5)吸取 100μl 细胞悬液(细胞总数为1x105 cell)至一新管中，加入5μl A

nnexin VFITC 和 5-10 μl PI，轻轻混匀，室温避光孵育15min。

2.样品检测

1)流式细胞仪检测:染色孵育后，每管加入400μl 1xBinding Buffer 工作液，

混匀后使用流式细胞仪检测(1小时内检测)。建议设置正常细胞、PI单染和An

nexin V-FITC单染3个对照组，正常细胞组可作为荧光补偿调节去除光谱重叠和

设定十字门的位置。若十字门的位置不易设定，可采用经凋亡诱导的细胞进行设

定。结果可用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图(two-color dot p

lot) ，FITC 为横坐标，PI为纵坐标。AnnexinV-FITC 和 PI联合使用时，活

细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细

胞有绿色和红色双重荧光。

2)荧光显微镜检测:染色孵育后涂片，显微镜下观察。使用荧光显微镜上的

蓝光和绿光通道分别观察FITC和 PI。被ANNEXIN V-FITC结合的细胞显示浆

膜上有绿色光环。丧失细胞膜完整性的细胞，细胞核显示红色，膜上有绿色光环。

送样运输要求:

1、活细胞邮寄(1*10^6个/样)

(1)用T25培养瓶培养细胞，处理后用完全培养基灌满T25培养瓶，留少许空气。

(2)瓶口与盖过火，拧紧，并用封口膜将瓶盖与瓶口结合处封起来，同时封瓶

盖。

(3)将细胞用防震材料(如泡沫)固定培养瓶，常温邮寄。

注:如果是武汉本地样品，则可将6孔板细胞带培养基冰上运输

2、冷冻细胞带六孔板直接邮寄(1*10^6个/样)

弃去培养基，尽量迅速吸干细胞培养皿/孔板/瓶中液体，-80℃速冻后干冰运

输，冷冻细胞带六孔板直接邮寄

3、冷冻细胞邮寄(1*10^6个/样)

弃去培养基，尽量迅速吸干细胞培养皿/孔板/瓶中液体，PBS润洗后胰酶消化

3MIN,加等体积的含血清完全培养基终止消化，离心去上清，只要细胞团，-80

℃速冻后干冰运输。